Phương pháp Multiplex PCR

Multiplex PCR

1.  Giới thiệu Phản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông thường, ở đó hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng.

2. Ứng dụng 2.1. Multiplex-PCR phát hiện và định type HSV Herpes sinh dục là một bệnh do virus Herpes Simplex HSV1 và HSV2 gây nên nhưng chủ yếu là HSV2. Là bệnh cấp tính lây truyền qua đường tình duc. Bệnh tái phát dai dẳng, người lành mang mầm bệnh và người bệnh kín đáo truyền  bệnh cho người khác.Bệnh có triệu chứng hoặc không có triệu chứng. Khi có triệu chứng: đối với Herpes sinh dục nguyên phát. Mụn nước thành chàm ở vị trí tiếp xúc kết hợp đau và viêm hạch bạch huyết. Tuổi mắc bệnh: ở người trẻ đang ở độ tuổi hoạt động tình dục. - Các xét nghiệm như Tzanck smear có thể thấy Tế bào đa nhân khổng lồ.  - HSV-Multiplex-PCR: Sử dụng hỗn hợp 3 primers, cho kết quả dương tính và có thể phân biệt được type1 hay type 2 qua độ dài sản phẩm PCR: HSV-1 có độ dài 503bp và HSV-2 có độ dài 435bp. - Hoặc HSV - PCR riêng biệt cho mỗi type HSV-1 cho sản phẩm 395bp và HSV-2 cho sản phẩm 302bp.

2.2. Chẩn đoán bệnh rối loạn tiêu hóa ở dê Sự phát hiện bằng kháng thể kết hợp kháng nguyên bệnh rối loạn tiêu hóa. HLA typing sử dụng multiplex PCR và phát hiện với biosensors. E. Nested PCR 1. Định nghĩa: Nested PCR là một dạng thay đổi của PCR thường, trong đó hai cặp mồi PCR được dùng để khuếch đại đoạn DNA. Phản ứng nested PCR phải được thực hiện hai lần. Lần đầu, phản ứng PCR được thực hiện trong 15 đến 30 chu kỳ, với cặp mồi thứ 1, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạn gen cần xác định nằm trong đoạn gen được khuếch đại lần 1. Sản phẩm PCR lần 1 sau đó sẽ là mẫu cho PCR lần 2, cặp mồi thứ 2 sẽ bắt cặp phía trong của sản phẩm PCR lần 1 và khuếch đại đoạn gen cần xác định.

2. Nguyên tắc

3. Ưu điểm - Tăng tính đặc hiệu là do sự bắt cặp của primer thứ hai chỉ xảy ra chủ yếu với đoạn gen được nhân lên bởi phản ứng PCR thứ nhất. Nếu ban đầu khuôn DNA bị khuếch đại sai thì khả năng khuếch đại ở lần thứ hai sẽ rất thấp - Tăng độ nhạy nhờ tổng số chu kỳ được thực hiện nhiều hơn Nested PCR áp dụng trong trường hợp có rất ít mẫu gốc 4. Nhược điểm lớn nhất của nPCR là gia tăng mức độ tạp nhiễm trong quá trình chuyển mẫu giữa hai lần chạy PCR. Tuy nhiên có thể khắc phục bằng cách cải tiến chạy nPCR trong một ống.

5. Ứng dụng 

Sử dụng nested PCR để phát hiện virus lở mồm long móng trên amidan của trâu bò bị giết mổ với biểu hiện lâm sàng bình thường xuất hiên ở Iran Aliasghar Baharif1*, Taghi Taghipour-Bazargani2, Otfried Marquardt3, Seyed Ali Ghorashi4, and Saied Bokaie2 1Junior School of Veterinary Medicine, Bu-Ali Sina University, Hamadan, Iran 2Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran 3Federal Research Center for Virus Diseases of Animals, Tűbingen, Germany 4National Institute for Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran Vật liệu và phương pháp Mẫu: Amidan được lấy từ 2 bò bản xứ ( giống Bos taurus và giống Bos indicus), cũng như từ Holstein-Friesians và con lai của chúng. Các con vật, cả hai cùng giới tính và tuổi khác nhau, có lâm sàng bình thường. Mỗi mẫu được chuyển vào một tube chứa PBS-glycerol (1:1) và giữ lạnh cho đến khi được kiểm tra tại Ferderal Research Center đối với bệnh virus ở động vật, Tubingen, Đức. Phân tách RNA: một mảnh nhỏ (30-50mg) của mỗi mẫu amidan được cắt nhỏ và ly giải trong buffer RLT được cung cấp bởi RNA extraction kit RNeasy

(QIAGEN, Germany). RNA được chiết xuất từ 350 μl của mô đồng chất, và tái huyền phù trong 20 μl DEPC-H2O. 5 μl của tổng RNA đã chiết được dùng cho phản ứng RT-PCR ngay lập tức. Nước cất được dùng như đối chứng âm.  Sự chọn lọc oligonucleotide: trình tự primer được chọn từ trình tự bộ gen được bảo tồn của gen virus RNA  polymerase. MOSS và HASS (1999) miêu tả rằng vùng ít biến động trong số kiểu huyết thanh FMDV và lý tưởng để khuếch đại và phát hiện tất cả 7 kiểu huyết thanh. Tên và trình tự primer như sau: PCR (external)primer: 3C1 antisense 5’-CGC TCT TCC ACA TCT CTG GT-3’ (nucleotide position O1 Kaufb.: 6329-6348) và 3A1 sense 5’-CCA CAA GCT GAA GGA CCC T-3’ (nucleotide position O1 Kaufb.: 5450-5468). Nested-PCR (internal) primers: 3C3 antisense 5’-GGC CTC ACC AGA GAA AATCA-3’ (nucleotide position O1 Kaufb.: 6054-6073) và 3C5 sense primer 5’- TAG AGC CAT GAC AGA CAG TG-3’ (nucleotide position O1 Kaufb.: 5851-5871).

Mẫu được khuếch đại bằng RT-PCR một bước đến thể tích cuối cùng 25 μl chứa 5 μl RNA và 1 μl mỗi mồi external sử dụng QIAGEN® OneStep RT-PCR kit. Chu trình nhiệt (1) 30 min. at 50 °C, (2) 15 min. at 95 °C, (3) 45 s. at 94 °C, (4) 45 s. at 55 °C, (5) 1 min. at 72 °C, (6) 10 min. at 72 °C; bước  (3)-(5) được lặp lại 40 chu kỳ. Một μl sản phẩm RT-PCR sau đó được khuếch đại bằng nested PCR,sử dụng mồi 3C3 và 3C5. Điều kiện chu tringf nhiệt tương tự như miêu tả ở trên. Mỗi phản ứng được phân tích bởi điện di trên gel và nhuộm ethidium bromide (4μg/ml). Sản phẩm nPCR được tinh sạch như đề nghị của Freiberg và ctv (1999) và nhuộm huỳnh quang để củng cố tính đặc hiệu của thử nghiệm. Phân tích thống kê: Phân tích dữ liệu thống kê được làm dựa trên Fischer’s exact test sử dụng phần mềm SPSS 11 . Kết quả 

  Kết quả band mẫu chạy nPCR có kích thước mong đợi (222bp) thì dương tính.

Kết quả  Kết quả band mẫu chạy nPCR có kích thước mong đợi (222bp) thì dương tính. 

Fig. 1. Nested-PCR for detection of FMD viral genome in tonsil tissue samples. M: DNA molecular marker (Ladder 100). Lane 1-5: Amplification of a 222 bp DNA fragment in positive tonsil tissue samples. Lane 6: Negative control