Phương pháp Real time PCR

Phương pháp Real time PC

1. Định nghĩa Kỹ thuật Real time PCR là một phương pháp khuếch đại gene và đọc kết quả được thực hiện đồng thời trong cùng một ống hay một giếng mẫu. Phương pháp này đòi hỏi phải có một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình vi tính cho phép xử lý kết quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại.   2. Nguyên tắc Thực chất hệ thống Real time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính.

Real-Time PCR cho biết kết quả lượng DNA hình thành ở từng thời điểm trong suốt tiến trình phản ứng

Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành.

3. Ưu điểm của Real-time PCR - Nhanh - Cho phép theo dõi tiến trình phản ứng và biết được lượng DNA  đã tạo thành ở từng thời điểm. - Không cần điện di >>> tiến hành được nhiều mẫu (gần 200 mẫu/ngày). - Hạn chế tạp nhiễm. - Độ nhạy cao (3pg DNA). - Lượng mẫu biến động (10-1010 copies). - Độ lặp lại cao (CV < 2,0%).

4. Vấn đề đối với Real-time PCR - Không phân biệt được tác nhân gây bệnh còn sống hay chết - Đòi hỏi kỹ năng  - Thiết bị 5. Ứng dụng Kỹ thuật Real time PCR chẩn đóan sớm HIV trên trẻ em  Eric Nerrienet HIV/Hepatitis Laboratory IP Cambodia, Phnom Penh Nếu không có sự tầm sóat sớm nhiễm HIV ở trẻ, BS Nhi Khoa phải chờ đợi đến tháng thứ 15 để có thể biết tình trạng huyết thanh học thực sự của trẻ sinh ra từ bà mẹ HIV(+) Nếu trẻ không được phát hiện sớm và điều trị thuốc kháng virus, trẻ có nguy cơ tử vong là 50% trong 02 năm đầu tiên của cuộc sống Kỹ thuật kinh điển trong chẩn đóan nhiễm HIV ở trẻ - RT PCR/b-DNA: Giá thành đắt

- Nested-DNA PCR (gen: Gag, Pol và/hoặc Env): Đắt, kỹ thuật phức tạp - Nuôi cấy và phân lập virus: Đắt, kỹ thuật phức tạp, mất nhiều thời gian,Cần labo an tòan mức độ 3 - Kỹ thuật real time PCR Để chẩn đoán sớm, giá thành thấp ở trẻ sinh ra từ mẹ nhiễm HIV • Phương pháp: • Kỹ thuật real time RT PCR thực hiện trên gene LTR (theo ANRS protocol) • Mẫu bệnh phẩm: • Huyết thanh của nhóm trẻ được chẩn đoán HIV (+) và nhóm trẻ HIV(-) ở Campuchia (n=226) và Việt Nam (n=38) • 145 trẻ em gái và 119 trẻ trai • Độ tuổi từ 1-28 tháng, độ tuổi trung bình 7,2 tháng)

• Độ đặc hiệu và độ nhạy tốt so vơí kỹ thuật kinh điển: kỹ thuật nested DNA PCR, RT PCR và kỹ thuật bDNA) • Nguỡng phát hiện : 400 cp/mL*, kỹ thuật thực hiện trên 200 μl huyết thanh. • Không cần giai đoạn sau khuếch đại • Độ lặp lại cao : trong cùng lần thử nghiệm, giữa các phòng xét nghiệm khác nhau. • Đơn giản • Nhanh • Giá thành rẻ

Ngoài ra, Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội (TPHà Nội) đã thực hiện thành công kỹ thuật Realtime – PCR để chẩn đoán xác định các tác nhân gây ung thư cổ tử cung . Kỹ thuật PCR có ý nghĩa ứng dụng rất quan trọng tỏng chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm mãn tính, như các bệnh do nhóm retrovirus ( bệnh leukaemia trên bò bonvine leukamia virus, bệnh viêm khớp/ viêm não trên dê- caprine arthritis/ encephalitis virus…) hoặc các bệnh có thời gian phát hiện chậm do nhóm herpesvirus ( bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm trên bò-infectious bovine rhinotracheitis và bệnh Aujeszky’s…)