Phương pháp tách DNA(thực vật)

Phương pháp tách DNA

DNA là đại phân tử có kích thước lớn , đối với sinh vật tiền nhân thường nằm ở nhiễm sắc thể vòng chứa DNA cấu trúc với Protein , loài ngoài ra ở một số sinh vật tiền nhân còn có thêm DNA phụ nằm trong các thể plasmid .Đối với sinh vật nhân thật DNA phần lớn nằm trong nhiễm sắc thể , trong nhân tế bào , một số lượng nhỏ nằm ở trong ty thể và lạp thể . để đảm bảo tách chiết được DNA bao gồm các bước sau.

Bước 1 :

Lấy mẫu để tách DNA

-         Lấy đúng mẫu cần phân tích , lượng mẫu cần nhỏ nhưng lại yêu cầu phải thu được nhiều DNA, thường dùng mô non , nơi tế bào đang phân chia mạch sẽ có nhiều nhân /đơn vị thể tích hơn .

-         Mẫu phải sạch , không bẩn hay bị nhiễm sâu , bệnh .

-         Bộ phận lấy mẫu , tùy từng sinh vật , nhưng không nên lấy mẫu là các cơ quan dự trữ có nhiều protein , gluxit hoặc lipid vì khi chiết xuất phải tốn công loại bỏ tạp chất này . Chọn mô nào chứa các tế bào có nhân to , vỏ tế bào mỏng còn non ,Đối với thực vật thường lấy lá mô non , lấy vào buổi sang , tốt nhất trước khi lấy nên che nắng vài ngày .

-         Mẫu lấy xong cần cần phải hạn chế ngay hoạt động của các enzyme DNase bằng cách làm lạnh bỏ ngay bào đá lạnh .

 Bước 2:

Phá vỡ thành tế bào và nhân

Nghiền tế bào (đối với sinh vật đa bào) trong nito long hoặc đá lạnh với dung dịch chiết xuất gồm các thành phần như sau:

Muối NaCl , Tris-HCl (Tris hydroxylmethyl ) amino methane , EDTA (ethylendiamine tetra acetic acid ) , SDS (sodium đoecyl sulphata) , proteinase K, để phá vỡ mảng tế bào và nhân , giải phóng ra DNA . Nhiệt độ lạnh và các hóa chất có tác dụng :

-         Nhiệt độ lạnh và EDTA làm giảm tối thiểu hoạt tính của men phân giải DNA (DNase).

-         SDS và proteinase K khi phối hợp với nhau sẽ có tác dụng phân giải và làm biến tính protein lien kết với DNA , Khi SDS bọc lấy Protein sẽ làm gẫy tất cả các liên kết không cộng hóa trị . Mecaptoethanol có tác dụng phá vỡ các liên kết disulfide giữa các subunit protein .

-         NaCl và Tris- HCl có tác dụng rửa carbohydrate,lipid và tinh bột .

Bước 3 :

Hòa tan DNA và loại bỏ tạp chất

-         Thành phần trong mẫu DNA khi chiết xuất thường chứa cả protein , RNA , carbohydrate và lipid , do vậy cần phải loại bỏ các tạp chất này ra khỏi dung dịch DNA , Hiện nay người ta người ta thường dung một số hợp chất để loại bỏ tạp chất trên như sau:

-         Dùng phenol/chloroform/isoamyl với tỷ lệ tương ứng là 25:24:1 để tách chiết DNA và kết tủa các protein , RNA , carbohydrate và lipid . sau ly tâm sẽ thu được phần dung dịch nước phía trên ống nghiệm chứa DNA hòa tan . phần kết tủa . Phần kết tủa nằm phía dưới đáy ống nghiệm là các tạp chất lẫn .

Bước 4 :

Kết tủa DNA

-         Mục đích kết tủa là nhằm thu được DNA ở dạng cô đặc , và bảo vệ chúng không bị phân hủy bới các enzyme DNase và khi cần thì lại hòa tan chúng theo nồng độ tùy ý .

để kết tủa DNA thì chúng ta thường dùng hai hóa chất đó là :

Kết tủa bằng Ethanol lạnh nồng độ 100% với lượng dư thừa từ 2 – 2.5 lần thể tích nhằm kết tủa hoàn toàn DNA , lúc này có thể nhìn thấy DNA kết tủa dưới dạng vẩn đục nhờ .Ethanol còn có tác dụng loại bỏ ra một số muối (trừ NaCl ) và nhiều phần tử hữa cơ nhỏ khác . Ngoài ra khi kết tủa bằng ethanol nếu kết hợp với ammonium acetate còn có tác dụng loại bỏ những oligonuleotitde (sợi đơn , kép dài <30bd) và những nucleotit tự do khác .

-Kết tủa bằng Isopropanol với lượng cho vào bằng lượng dung dịch mẫu phương pháp này có nhược điểm là khó loại trừ  được một số muối khó hòa tan trong isopropanol , nên các muối này thường kết tủa cùng với DNA , do vậy cần phải rửa them nhiều lần để loại bỏ hết các muối còn lẫn tạp.

- Sau khi kết tủa mạng đi ly tâm sẽ thu được DNA cô đặc (pellet) , sawu đó rửa pellet nhiều làn bằng 70% ethanol , làm khô tự nhiên để bay hơi hết ethanol , hòa tan DNA pellet bằng dung dịch TE ( thành phần gồm 10 mM Tris-HCl , pH 8.0  ,1mM EDTA , pH 8.0 ) cuối cùng bảo quản trong tủ lạnh -  C hoặc -  C

hằng năm.